Transferentia de proteinas
| Transferentia de proteinas |
|---|
| instantia de: analytical chemical technique[*] |
| subclasse de: immunoblotting[*], protein method[*] |
 |
|
|
| Commons: Western blot |
Le transferentia de proteinas, in anglese western blot (equalmente appellate western blot o ancora technica de immuno-impressiones)[1], es un methodo de biologia molecular permittente le detection e le identification de proteinas specific in un specimen biologic (serum o altere extracto o homogenato texital) con le adjuta de anticorpores dirigite contra iste proteinas que on desira deteger. Le western blot permitte assi visualisar proteinas particular in un mixtura complexe. Illo es un del technicas analytic de transferentia sur membrana utilisate in biochimia e in biologia molecular.
Illo es a vices utilisate como un instrumento de diagnose complementari pro mitter in evidentia un proteina particular (proteina viral, per exemplo) in le serum de un patiente.
Technica
[modificar | modificar fonte].jpg)
Iste technica, nascite del progressos del proteomica, del biologia molecular e del immunofluorescentia, utilisa le electrophorese sur gel de polyacrylamida pro separar proteinas, previemente denaturate, secundo lor talia.
Iste proteinas es postea transferite ab le gel sur un membrana (typicamente de nitrocellulosa), ubi illos es exponite a un anticorpore specific del proteina de interesse. Il es possibile gratias a iste technica deteger le presentia de un proteina in un texito, evalutar su talia, su concentration, le variationes de iste concentration, effectuar comparationes de concentrationes inter differente gruppos, etc. Altere technicas utilisante le anticorpores permitte le detection del proteina in le cellulas post fixation (immunocytochimia) e in le texitos (immunohistochimia).
Le methodo esseva elaborate in le laboratorio de George Stark a Stanford. Le nomine del western blot, date al technica per W. Neal Burnette[2], es un joco de parolas a partir del technica del Southern blot o transferentia de Southern, technica de detection de ADN nominate secundo su inventor, Edwin Southern e non secundo le puncto cardinal. Le detection de ARN es appellate northern blot o transferentia de northern. Tote iste technicas deriva lor nomine del etapa de transferentia sur membrana, comparate a un impression sur papiro bibule (blot = « macula » in anglese).
Differente etapas del transferentia de proteinas
[modificar | modificar fonte]
Preparation del specimens
[modificar | modificar fonte]Le specimens (de un texito o de un cultura cellular) es rapidemente infrigidate, o mesmo refrigerate (infra Patrono:Unitate). Illos es homogenisate per sonication (utilisation de ultrasonos pro rumper le membranas), per fortia mechanic o simplemente lysate per le uso de tampones a alte concentration de sales. Illo resulta in un homogenato de tote le compartimentos cellular, que pote esser usate tal qual o esser submittite a plure etapas de centrifugation differential pro isolar le fractiones cytosolic, nuclear e membranari. Le specimen es postea tractate de maniera a colliger un rata constante de proteinas a partir de cata specimen differente. Isto implica un dosage del proteinas per le methodo del Biuret o del blau de Coomassie (methodo de Bradford).
Le specimens es postea bullite durante 1 a 5 minutas in un solution tampon de electrophorese (per exemplo le tampon de Laemmli), continente un substantia tampon, generalmente Tris, un colorante, un componente sulfhydryl (typicamente beta-mercaptoethanol o dithiothreitol o plus simplemente DTT), un detergente anionic lipophile (sodium dodecyl sulfato o SDS) e glycerol pro diminuer le pulsion de Archimedes. Le pulsion de Archimedes move un corpore immergite in un fluido verticalmente verso in alto.
Le ebullition denatura le proteinas per rumper le debile ligamines intramolecular, lo que ha como consequentia le distender los completemente. Le SDS provide a illos tunc un ambiente ric in cargas negative pro solvatar los e prevenir le precipitation, e le componente sulfhydryl impedi le regeneration del pontes disulfuro. Le glycerol augmenta le densitate del specimen in relation al tampon in le parte superior del reservoir del gel, facilitante le insertion del specimens que descendera plus facilemente al fundo del compartimentos del gel.
Electrophorese in gel
[modificar | modificar fonte]Le proteinas del specimen es separate secundo lor talia per electrophorese in gel, de qual le composition varia in function del laboratorio, del peso molecular del proteinas de interesse e del tampones disponibile. Le geles de polyacrylamido es le plus frequente. Como le proteinas transversa le gel solmente in un dimension (de alto a basso), le specimens es cargate le un juxta le altere in puteos formate in le gel. Le proteinas es separate per massa in "bandas" in cata "camino" formate sub le puteos. Un camino es reservate a un "marcador" o "scala standard", un mixtura de proteinas possedente pesos molecular definite disponibile in le commercio.
Il es tamben possibile emplear un gel 2D que, a partir de un sol specimen, permitte facer migrar le proteinas in duo dimensiones. Le proteinas es alora separate per lor puncto isoelectric (es dicer le pH al qual lor carga nette es neutre) in le prime dimension, e secundo lor peso in le secunde.
Le composition de un tampon de electrophorese (running buffer) pro le transferentia de proteinas es de un volumine de tampon TGS (Tris-glycina-SDS) diluite 10 vices in 9 volumines de aqua distillate.
Transferentia super membrana
[modificar | modificar fonte]
A fin de render le proteinas accessibile al detection per anticorpores, illos es transferite ab le gel super un membrana de nitrocellulosa o de PVDF. Le membrana es placiate facie a facie con le gel, e un currente electric es applicate al grande placas sur un del duo lateres. Le proteinas cargate migra ab le gel verso le membrana conservante le organisation relative que illos habeva in le gel. Il resulta de iste transferentia que le proteinas es exponite sur un superficie tenue, lo que facilita le etapas de detection ulterior. Tanto le membranas de nitrocellulosa como de PVDF es "collante", ligante proteinas de maniera non specific (es dicer que illos liga tote le proteinas presente in le monstra del mesme modo). Le fixation del proteinas al membrana se face gratias a interactiones hydrophobe e ionic inter le membrana e le proteinas. Ben que le membranas de nitrocellulosa es minus car que illos in PVDF, illos es minus solide e non pote esser empleate plure vices. A differentia de illos in nitrocellulosa, le membranas de PVDF debe esser imbibite de methanol o de isopropanol a 100 % ante lor utilisation.
Le composition pro un litro de un tampon de transferentia typo es de:
Coloration del proteinas
[modificar | modificar fonte]Iste etapa visualisa le proteina total que ha essite transferite con successo al membrana. Le coloration del proteinas permitte al usator de verificar le uniformitate del transferentia de proteinas e de effectuar un normalisation ulterior del proteina de scopo con le quantitate real de proteinas per via. Le normalisation con le assi-nominate "controlo interne" esseva basate super le immunocoloration de proteinas constitutive o de proteinas structural (como le actina o le tubulina) in le procedura classic, sed se dirige verso le coloration de proteinas total recentemente, a causa del avantages multiple[4]. Al minus septe approches differente pro le coloration de proteinas total ha essite describite pro le normalisation de Western blot: Ponceau S, technica stain-free, Sypro Ruby, Epicocconone, Coomassie R-350, Amido Black e Cy5[4]. A fin de evitar le ruito del signal, le coloration del proteinas debe esser effectuate ante le blocage del membrana. Tamen, colorationes post-anticorpore ha anque essite describite[5].
Blocage
[modificar | modificar fonte]Post que le membrana ha essite seligite pro su proprietates de ligamine non-specific, e como tanto le proteina de scopo como le anticorpores es proteinas, precautiones debe esser prendite pro minimisar le interactiones inter membrana e anticorpores. Le blocage del sitos de interaction non-specific inter le membrana e le anticorpores es realisate per immerger le membrana in un solution diluite de proteinas - le plus frequentemente albumina de sero bovin o ASB (BSA in anglese) o lacte sin grassia (lacte diluite a 5 % - 5 g pro 100 ml) - in presentia de detergente, typicamente Tween 20), durante un hora a temperatura ambiente.
Le proteinas in le solution diluite se liga al membrana in tote le sitos non occupate per le proteina de scopo.
In iste modo, quando le anticorpores es applicate durante le etapa sequente, illos non pote (idealmente) plus ligar se al membrana excepte in le sitos de ligamine del proteina de scopo, lo que reduce le "ruito de fundo" in le producto final del transferentia de proteinas, produce resultatos plus clar e elimina le falsos positive.
Detection
[modificar | modificar fonte]Durante le detection, le membrana es "explorate" pro le proteina de interesse con anticorpores, ligate postea a un enzyma que emitte un signal photometric o colorimetric, o ben photones. Pro plure rationes, isto occurre classicamente in duo etapas, ben que methodos in un sol etapa es disponibile pro certe applicationes.
Methodo in duo etapas
[modificar | modificar fonte]Anticorpore primari
[modificar | modificar fonte]Le anticorpores es generate per inoculation al animal (generalmente un lepore o un capra) o exposition de un cultura de cellulas immunitari al proteina de interesse in su integralitate o solmente sur un de su fractiones (epitopo). Totevia, post que le proteinas ha essite denaturate durante le electrophorese sur gel, on debe utilisar anticorpores que recognosce specificamente le proteina denaturate, e non le proteina native.
Le responsa immunitari normal es in iste caso exploitate pro generar anticorpores que es recolligite e utilisate como instrumentos de detection possedente simultaneemente un bon sensibilitate e un bon specificitate, ligante se directemente al proteina - de ubi lor appellation de anticorpore "primari". Alcun anticorpores monoclonale, multo plus difficile a realisar e de quales le affinitate es multo plus elevate, pote equalmente esser utilisate in transferentia de proteinas.
Post le blocage, un solution diluite de anticorpore primari (generalmente comprendite inter 0,5 e 5 microgrammas/ml) es incubate con le membrana sub agitation moderate. Le solution se compone typicamente de un tampon salin proxime al pH neutre (generalmente, un parve quantitate de chloruro de sodium), de un parve percentage de detergente, e a vices de proteinas (ASB o lacte 5 %) diluite. Le solution de anticorpore e le membrana pote esser sigillate in un sacchetto de plastico e incubate insimul pro un duration de 30 minutas a un nocte. Illo pote anque esser incubate a differente temperaturas, le temperaturas plus elevate essente associate a ligamines plus specific.
Anticorpore secundari
[modificar | modificar fonte]Post rincage del membrana pro remover le anticorpores primari non ligate, isto es exponite a un altere anticorpore, dirigite contra un portion specie-specific del anticorpore primari. Iste anticorpore es cognoscite como anticorpore "secundari", e tende a esser referite, a causa de su proprietates de adressamento, como "anti-mus", "anti-capra", "anti-lepore", etc. Le anticorpores es de origine animal (sed generalmente, de species differente del specie del anticorpore primari), o de culturas de hybridomas de origine animal; un anticorpore anti-mus se ligara a practicamente omne anticorpore primari de origine murin, lo que permitte realisar economias permittente al laboratorio compartir un sol fonte de anticorpore secundari, e permitte resultatos plus reproducibile. Le anticorpore secundari es generalmente ligate al biotina o a un enzyma que permitte le identification visual del proteina studiate sur le membrana, como un phosphatase alkalin o le peroxydase de armoracia. Iste etapa confere un avantage, proque plure anticorpores secundari se ligara a un anticorpore primari, permittente meliorar le signal.
Plus communemente, un anticorpore secundari ligate al peroxydase de armoracia (horseradish peroxidase) es utilisate in conjunction con un agente luminescente, e le producto del reaction emitte un luminescentia proportional al concentration de proteina. Un pellicula photographic sensibile es placiate contra le membrana e, sub le exposition del lumine debite al reaction, crea un imagine del anticorpores ligate al membrana. Plus frequentemente ora, un camera con CCD es utilisate in loco de pelliculas photographic.
Como pro le proceduras de ELISPOT e ELISA, le enzyma pote esser fornite con un molecula-substrato que essera convertite per le enzyma pro emitter un producto de reaction colorate, visibile sur le membrana.
Un tertie possibilitate consiste in utilisar un marcator radioactive in loco de un enzyma copulate al anticorpore secundari, per exemplo marcante un proteina que liga le anticorpores, tal como le proteina A del staphylococcus con un isotopo radioactive del iodo. Tamen, proque le altere methodos es plus secur, plus rapide e minus car, iste methodo ha plus o minus cadite in desuetude, sed remane a vices utilisate in certe circumstantias.
Methodo in un etapa
[modificar | modificar fonte]Quando le technica appareva, le processo de detection esseva realisate in duo etapas, a causa del relative facilitate de production del anticorpores primari e secundari in duo processos distincte. Isto permitte al cercatores e fornitores un certe flexibilitate de uso, e adde un etapa de amplification del signal al processo de detection. Totevia, depost le arrivata de analyses de proteinas a alte rendimento e a margine de detection plus basse, es a dicer, detectante proteinas a multo basse concentration, il ha devenite interessante de disveloppar systemas de sondage in un sol etapa que permittera un gania de tempore e un economia de materia prima. Iste systemas necessita un anticorpore de detection que pote simultaneemente detectar le proteina de interesse e emitter un signal detectabile, le quales es frequentemente disponibile pro marcatores de proteina cognoscite. Le sonda primari es incubate con le membrana al maniera del anticorpore primari in le processo in duo tempores, e es postea parate pro le detection directe post un serie de etapas de rincage.
Analyse
[modificar | modificar fonte]Post rincage del anticorpores secundari non ligate, le transferentia de proteinas es parate pro le detection del sondas marcate e ligate al proteina de interesse. In practica, non tote le transfertas de proteinas revela le proteina sur un banda determinate del membrana, proque le geles non es completemente exempte de proteinas post haber essite tamponate. Un approximation del dimension es realisate per comparar le bandas marcate con illos del marcatores del scala standard cargate durante le electrophorese in un puteo separate. Le processo es repetite pro un proteina structural, como le actina o le tubulina, de qual le concentration non deberea variar inter le monstras (controlo interne). Le concentration del proteina-target es indexate a illo del proteina que servi como controlo interne, a fin de normalisar le experientias. Iste practica permitte le correction in relation al rata de proteinas total sur le membrana, in caso de error o de transferta incomplete.
Detection colorimetric
[modificar | modificar fonte]Iste methodo depende, durante le incubation del transferta de proteinas, del presentia de un substrato que reage al activator presente sur le anticorpore secundari (como le phosphatase alkalin). Isto converte un colorante solubile in un forma insolubile, de color differente, que precipita juxta le enzyma, tingente assi le membrana de nitrocellulosa. Le developpamento del transferta de proteinas es tunc arrestate per rincage del colorante solubile. Le concentration de proteina es evalutate per densitometria, evalutation del intensitate del banda o per spectrophotometria.
Detection per chimiluminescentia
[modificar | modificar fonte]
Iste methodo necessita, durante le incubation del transferta de proteinas, le presentia de un substrato que emitte lumine post exposition al activator presente sur le anticorpore secundari. Le lumine emittite servi a impressionar un film photographic, o plus recentemente, per cameras CCD que restitue un imagine digital del transferta de proteinas. Le imagine es analysate per densitometria, que evaluta le rata relative de marcation del proteina, e quantifica le resultatos in lo que concerne le densitate optic. Softwares permitte un analyse plus avantiate del datos, como le analyse del peso molecular si le standardes appropriate es utilisate. Iste methodo appellate detection meliorate del chimiluminescentia (enhanced chemiluminescent, ECL) es considerate como un del methodos de detection le plus sensibile pro le analyse del transferentias de proteinas.
Detection per autoradiographia
[modificar | modificar fonte]Le marcation radioactive non require un substrato enzymatic, sed permitte le uso de filmes utilisate in medicina pro le imagine a radios X. Le filme es directemente placiate super le membrana, que se developpa durante su exposition al marcator e crea regiones obscur, le quales corresponde al bandas del proteina de interesse (cf. illustration). Le importantia del methodos de detection per radioactivitate es in declino, a causa de su costo e de technicas plus secur como le ECL.
Detection per fluorescentia
[modificar | modificar fonte]Le sonda copulate al anticorpore es excitate per un radio monochromatic e le emission resultante es tunc detegite per un photosensor, per exemplo un camera CCD equipate con le filtros de transmission appropriate, que restitue un imagine digital del transferentia de proteinas e permitte un analyse plus fin tal como le analyse del peso molecular o quantitative del transferentia de proteinas. Le fluorescentia es considerate como de un nivello approximatemente equivalente al chimiluminescentia pro le analyse del transferentias de proteinas. Illo require un apparatura plus costose totevia.
Differentia inter fluorescentia e chimiluminescentia
[modificar | modificar fonte]Ben que de mechanismo photophysic simile, chimiluminescentia e fluorescentia non es le mesme cosa:
- le fluorescentia face referentia al excitation de un molecula ab un stato stabile verso un stato excitate, e su retorno al stato basal per emission de un radiation in le spectro electromagnetic de un longitude de unda date, e specific del molecula.
- le chimiluminescentia face referentia al situation in le qual un molecula es formate in un stato excitate, como producto de un reaction chimic, e retorna verso un stato basal con emission de un radiation in le spectro electromagnetic de un longitude de unda date.
Sondage secundari
[modificar | modificar fonte]Un del plus grande differentias inter le membranas de nitrocellulosa e illos de PVDF es ligate a lor capacitate de supportar le "distachamento" (stripping) de anticorpores e le reutilisation del membranas pro sondages per altere anticorpores. Ben que existe protocollos ben stabilite pro le reutilisation del membranas de nitrocellulosa, le PVDF, plus spisse, permitte realisar iste manoeuvras con tote securitate e facilitate, e plus de usos ulterior ante de esser, tal como un palimpsesto, recoperte de signales parasite. Un altere differentia importante es que le PVDF, contrariemente al nitrocellulosa, debe esser immersite in ethanol a 95 % o isopropanol ante le uso. Le membranas de PVDF tende anque a esser plus spisse e plus resistente al damnos physic ligate a lor uso normal.
Applicationes medical in diagnostica
[modificar | modificar fonte]- Le tests VIH de confirmation emplea le methodo del transferentia de proteinas pro deteger un anticorpore anti-VIH in un specimen de serum. Proteinas de cellulas que on sape infectate per le VIH es separate e transferite super membrana como describite previemente. Le serum a testar es applicate. Le etapa de incubation in le anticorpore primari; le anticorpores libere es eliminate per rincage del membrana, e un anticorpore dirigite contra le proteinas human secundari associate a un enzyma o un chromophoro es addite. Le bandas marcate indica tunc le proteinas contra le quales le serum del patiente contine anticorpores.
- Le transferentia de proteinas es egalmente utilisate pro le test de confirmation del ESB (nominate "morbo del vacca folle").
- Certe formas de detection del morbo de Lyme utilisa le transferentia de proteinas.
Referentias
- ↑ Vide le articulo Transferentia (biologia) pro un complemento sur le terminologia francese.
- ↑ Patrono:Article
- ↑ Patrono:Ligamine web
- 1 2 Patrono:Article
- ↑ Patrono:Article